این پست وبلاگ با مشارکت Eurofins Discovery، یک رهبر جهانی در تست های علمی و خدمات آزمایشگاهی برای پیشبرد کشف دارو و سلامت انسان نوشته شده است.
شناسایی امیدوارکننده‌ترین ضربه‌ها و سرنخ‌ها با خواص مشابه دارو در کوتاه‌ترین زمان، هدف اصلی در کشف دارو است. کاندیداهای موفق پیش بالینی با استفاده از استراتژی‌های آماری قوی انتخاب می‌شوند. برای انجام یک کمپین موثر کشف دارو، درک مزایایی که می توان از هر مرحله از یک آبشار شناسایی کلی ضربه به دست آورد، ضروری است. به منظور نشان دادن واضح این مزایا، Eurofins Discovery یک مطالعه عمیق روی PIM3 کیناز با استفاده از غربالگری با توان بالا (HTS) و غربالگری مبتنی بر قطعه (FBS) انجام داد.
کیناز PIM3 برای این مطالعه موردی انتخاب شد زیرا کشف دارو برای مهارکننده‌های کیناز به دلیل حفظ مکان‌های فعال و سطح بالای همولوژی ساختاری بین کینازها که می‌تواند منجر به مسائل ایمنی شود، چالش برانگیز است. با استفاده از یک آبشار غربالگری جامع طراحی شده توسط کارشناسان بیوفیزیک HTS و Eurofins Discovery، این تیم توانست به سرعت مهارکننده های انتخابی PIM3 کیناز را از کتابخانه های اختصاصی این شرکت شناسایی کند. نتایج مثبت حاصل از این مطالعه موردی پایه محکمی را ارائه می‌کند که نشان می‌دهد این تکنیک‌ها را می‌توان برای شناسایی سریع سری‌های سرب نوآورانه و حساس برای سایر برنامه‌های Hit-to-Lead استفاده کرد.
اولین گام در این مطالعه، اجرای یک آبشار HTS بود که تمام مراحل توسعه سنجش را برای غربالگری اولیه یکپارچه می‌کرد (آزایش‌های ADP-Glo™ PIM3 کیناز فعال نوترکیب تولید شده توسط Eurofins DiscoverX®). سپس این تیم سنجش‌های بیوفیزیکی، بیوفیزیکی MST-TRIC Spectral Shift و NanoBRET™ سلولی را بر اساس درگیری هدف (TE) برای تأیید و رتبه‌بندی ضربه‌های کیناز PIM3 انجام داد. سنجش‌های متعدد خارج از قفسه برای بررسی سریع گزینش‌پذیری ضربه برای کیناز PIM3 در مقابل کینازهای PIM1 و PIM2 و کل کینوم، و همچنین ویژگی‌های اولیه ADME، به عنوان مثال، ترکیب شدند. حلالیت و پایداری میکروزوم انسان/موش
غربالگری با توان بالای PIM3 کیناز و غربالگری مبتنی بر قطعه
PIM3 کیناز فعال نوترکیب توسط DiscoverX® تولید شد تا یک سنجش اولیه ADP-Glo™ با کارایی بالا را توسعه دهد که برای غربالگری زیرمجموعه ای از کتابخانه PlatinumDiv+ Eurofins Discovery (71000 ترکیب) استفاده می شود. مجموعه داده های با کیفیت بالا (Z’ = 0.05 ± 0.86) با نرخ ضربه 1.54٪ به دست آمد که امکان انتخاب 1000 ضربه را فراهم می کند (946 منحنی پاسخ دوز معتبر ADP-Glo™ (DRC) که pIC50 را بین 3.42 تا 7.72 نشان می دهد).
فاز DRC قابلیت اطمینان و کیفیت بالا (95.6% تایید ضربه) داده های به دست آمده از صفحه نمایش اولیه ADP-Glo را تایید کرد. در این مرحله، شناسایی امیدوارکننده‌ترین ترکیبات از طریق یک رویکرد متعامد مانند سنجش‌های بیوفیزیکی و همچنین استفاده از سنجش درگیری هدف سلولی با روش PIM3 NanoBRET™ ضروری بود. قبل از فاز DRC، ساختار و خواص شیمیایی 946 ضربه تایید شده توسط تیم شیمی دارویی Eurofins Discovery مورد بررسی قرار گرفت تا 140 مورد قابل قبول برای آزمایش بیشتر با استفاده از آنالیزهای متعامد انتخاب شود.
پس از تایید توسعه سنجش، فناوری Spectral Shift رتبه بندی ترکیبات را بر اساس میل ترکیبی (Kه ارزش های). از 946 ضربه تایید شده، 140 مولکول انتخاب شده سپس در یک آزمایش دوز-پاسخ، یک سری رقت دو برابری 30 میکرومولار مورد آزمایش قرار گرفتند. از 140 ترکیب، 128 به عنوان بایندر کیناز PIM3 شناسایی شدند (92٪ نرخ ضربه). 22 ترکیب میل ترکیبی را در محدوده ساب میکرومولار نشان دادند (شکل 3-A). برای تایید قدرت اتصال و اثر تثبیت کننده آنها، 19 چسب قوی تر PIM3 توسط TSA آزمایش شدند (شکل 3). همه ترکیبات تثبیت چشمگیر PIM3 را با افزایش 3 تا 12 درجه سانتیگراد در مقایسه با apo-PIM3 کیناز نشان دادند.
**شکل 3. بیوفیزیک به عنوان آنالیز متعامد برای تریاژ ضربه اتصال استفاده می شود.** توزیع فراوانی بایندرها با K آنهاه
علاوه بر تأیید MST-TRIC، 140 ترکیب انتخابی با استفاده از روش نانوBRET™ TE سلولی PIM3 کیناز تأیید شد (0.06 ± 0.83 Z’). از 140 ضربه شناسایی شده، 128 بایندر در MST-TRIC (pK) تایید شده از 3.63 تا 8.03) و 67 بازدید در سنجش NanoBRET™ (pIC50 از 5.55 تا 6.71). پس از مرتب سازی، 16 بازدید توزیع شده در 6 خوشه ذخیره شد و در KinaseProfiler™ (فعالیت کیناز) و KINOME اختصاصی Eurofins Discovery مشخص شد.اسکن کردنپلتفرم های ® (تست لینک رقابتی هدایت شده توسط سایت فعال). KinaseProfiler™ و KINOMEاسکن کردنبرای مطالعه گزینش پذیری ضربه ها در برابر کینازهای PIM1 و PIM2 (IC50 & K) استفاده شد.ه) و کمک به شناسایی دو خوشه که گزینش پذیری معقولی برای کیناز PIM3 نشان می دهند. به طور موازی، 16 بازدید به دلیل حلالیت و پایداری مشخص شدند، که منجر به انتخاب سه از شش خوشه برای راه اندازی برنامه Hit-to-Lead شد.
به موازات مطالعه HTS و بیوفیزیک بر روی کیناز PIM3، Eurofins Discovery دومین استراتژی شناسایی ضربه را انجام داد: یک آبشار FBS با کتابخانه Eurofins Discovery Fragment ProbeSet. این تیم از MST-TRIC Spectral Shift به عنوان آنالیز اولیه و آنالیز حرارتی (TSA) به عنوان آنالیز تاییدی استفاده کردند.
از مجموعه ای از 826 قطعه، 91 بایندر بالقوه (11٪ نرخ ضربه) در صفحه نمایش تک دوز شناسایی شد و 69 قطعه به عنوان بایندر PIM3 با K تایید شد.ه مقادیر از 6.31 میکرومولار تا 25.1 میکرومولار. 33 ضربه اول قطعه در TSA مورد آزمایش قرار گرفتند و شش قطعه به عنوان تثبیت کننده (∆Tm> 1 درجه سانتی گراد) شناسایی شدند. از طریق مطالعه مکانیسم اثر (MoA)، Eurofins Discovery سه چسب آلوستریک را شناسایی کرد که نوید بخش‌هایی را برای کار آینده روی زیست‌شناسی ساختاری PIM3 می‌دهد.
نتیجه
همانطور که توسط مطالعه موردی Eurofins Discovery مشخص شد، دو آبشار غربالگری قوی مکمل با موفقیت بر روی کیناز PIM3 اجرا شد. کمپین HTS شناسایی مهارکننده‌های کیناز بسیار حساس و انتخابی را در عرض چند هفته امکان‌پذیر کرد و پایه‌ای محکم برای برنامه‌های Hit-to-Lead و Lead Optimization بعدی فراهم کرد. استراتژی FBS شناسایی لیست کوتاهی از قطعات امیدوارکننده به همراه اطلاعات بسیار ارزشمند، از جمله قدرت اتصال آنها، نشانه های محل اتصال آنها، و همچنین توانایی آنها برای تثبیت PIM3 را امکان پذیر کرد.
رویکرد HTS می‌تواند به سرعت و به طور موثر نامزدهای پیش بالینی قابل اعتمادی را ایجاد کند و با رویکرد FBS، مکان‌های اتصال جدید را می‌توان جدا کرد. علاوه بر این، می توان از اصابت قطعه برای ایجاد مولکول های کوچک با انجام رویکرد رشد قطعه یا رویکرد اتصال قطعه استفاده کرد.
این استراتژی‌های غربالگری اهمیت دسترسی به کتابخانه‌های با کیفیت بالا از ترکیبات، پروتئین‌های خالص شده و فناوری‌های مختلف مورد استفاده برای HTS و FBS را نشان می‌دهد. همراه با مدیریت پروژه موثر و مهارت های تحقیقاتی، آنها به کمپین های موفق و با کارایی بالا برای دستیابی به موفقیت منجر می شوند.